曹雪涛课题组发掘天然免疫性调整新机制,陈帅

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心脏搏动过程中,心肌细胞中钙离子在细胞浆与肌浆网之间穿梭是实现心肌兴奋-收缩耦联的关键步骤,这一过程发生紊乱会导致包括心衰在内的诸多心脏疾病。因此,在由于细胞浆/肌浆网钙穿梭异常导致的心脏疾病治疗中,恢复心肌细胞的钙稳态是一种非常诱人的药物研发策略。心肌细胞中,SERCA2a是一个位于肌浆网上的钙-ATP酶,其主要功能是通过水解ATP介导钙离子从细胞浆到肌浆网内的转运,从而控制心肌舒张。在成熟的小鼠心肌细胞中,大约95%的胞浆钙离子是由SERCA2a重新回收到肌浆网内的。SERCA2a表达量或活性降低都延迟会肌浆网对钙离子的重回收,进而导致肌肉舒张/收缩减弱。因此,以SERCA2a为分子靶点恢复心肌细胞钙稳态、进而治疗心衰等心脏疾病具有非常大的前景。然而,SERCA2a功能调控机制到目前为止尚不十分清楚,而此类调控机制的解析有助于为以SERCA2a为靶点进行药物研发提供新思路。

8月5日,国际期刊《糖尿病》(Diabetes)在线发表了中国科学院上海生命科学研究院营养科学研究所乐颖影组的最新研究成果MicroRNA-451 Negatively Regulates Hepatic Glucose Production and Glucose Homeostasis by Targeting Glycerol Kinase Mediated Gluconeogenesis。该研究发现miR-451通过靶向肝脏甘油激酶调控肝脏糖异生,在维持血糖稳态中发挥重要作用,揭示了甘油激酶调控糖异生的分子机制。

在机体的免疫系统中,免疫细胞与病毒每天都在上演“警察抓罪犯”的斗争。浙江大学与第二军医大学、中国医学科学院的合作研究发现:在免疫细胞的细胞膜上,凝集素Siglec-G充当了“叛徒”——它帮助RNA病毒降解细胞内的“警察”,从而使病毒逃过免疫细胞的监控,长驱直入。这项研究是在浙江大学医学院免疫学研究所所长、第二军医大学免疫学研究所所长、中国医学科学院院长曹雪涛院士的指导下完成的。研究发现了机体天然免疫调控的新机制,相关论文“Induction of Siglec-G by RNA Viruses Inhibits the Innate Immune by Promoting RIG-I Degradation”(《Siglec-G促进RIG-I降解负向调控抗RNA病毒固有免疫》)发表在1月31日出版的《Cell》杂志上。RNA病毒是生物病毒的一种,它们是艾滋病、SARS、甲型肝炎等疾病的“元凶”。对于这类病毒,巨噬细胞、树突状细胞等天然免疫细胞充当了“第一道防线”,感知、识别外源病原体的入侵。在这些细胞内,一种叫“ RIG-I(维甲酸诱导基因-I)”的基因发挥关键作用,它们就像一群巡逻的“警察”,能识别入侵细胞的RNA病毒,并触发信号通路而诱导I型干扰素产生,“捉拿”病毒。当前,RIG-I信号调控的分子机制是免疫学领域的研究重点和热点。论文的第一作者,浙大免疫学研究所的陈玮琳副教授说,通过基因芯片筛选发现,在RNA病毒感染后,免疫细胞膜上的Siglec-G(唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素-G)表达增加,而细胞内的“警察”——RIG-I 的数量减少了,“这两者存在怎样的关系?是否提示了病毒逃逸免疫监控的机制?”课题组的进一步研究回答了这些问题。通过蛋白质谱分析和免疫共沉淀技术,研究组终于发现Siglec-G是怎样充当RNA病毒“帮凶”的:Siglec-G数量的增多,能把“警察”RIG-I一个个地降解,这样一来,“警察”数量锐减了,它们所活化的信号通路和触发的I型干扰素就受到了抑制,病毒就此逃脱机体的免疫监控。课题组在小鼠模型的体内实验亦表明,Siglec-G失活,可以保护小鼠免受致命性RNA病毒感染。同时,课题组还找到了Siglec-G使RIG-I降解的关键位点。曹雪涛院士介绍说:“这为人们了解抗病毒固有免疫反应,寻求治疗病毒感染性疾病的新途径,以及研制抗病毒药物的新靶点都具有非常重要的意义。”(周炜)

2018年12 月19日,模式动物研究所陈帅教授课题组在国际主流期刊《Circulation Research》上在线发表题为“SPEG Controls Calcium Re-uptake Into The Sarcoplasmic Reticulum Through Regulating SERCA2a By Its Second Kinase-Domain ”的论文。该研究从蛋白质组学入手,发现SERCA2a可以与横纹肌特异性表达的蛋白激酶相互作用;通过一系列深入研究证明了SPEG是SERCA2a的一个全新调控因子,可调控钙离子在细胞浆与肌浆网之间的穿梭。这项研究揭示了心脏钙稳态调控的一种新机制,为钙稳态异常导致的心脏疾病的发病机理及治疗提供了新思路。

microRNA是一类含20-25个核苷酸的单链非编码RNA,通过与靶基因mRNA的3’非翻译区结合而使mRNA降解或抑制mRNA的翻译,从而在转录后水平调控靶基因表达,在各种生理病理条件下影响代谢稳态。肝脏是机体重要的糖代谢器官之一,在维持血糖稳态中发挥重要作用。肝脏胰岛素抵抗和产糖增加在2型糖尿病的发生发展中起重要作用。microRNA参与代谢调控及2型糖尿病的发生发展,但机制尚不完全清楚。

SPEG属于肌球蛋白轻链激酶亚组钙调蛋白激酶丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族的一员。其C端含有两个串联的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域,其第一个激酶结构域与MLCK亚组的其他成员具有更高的同源性。之前有研究表明,SPEG不仅是心脏发育所必需的、也是维持成年小鼠心脏功能所必不可少的;但是到目前为止仍然不清楚SPEG是如何来调控心脏功能的。

乐颖影指导的博士后卓鉥等人发现,miR-451在高脂饮食诱导的糖尿病小鼠和db/db小鼠的肝脏中表达升高。通过腺病毒介导在小鼠肝脏过表达或抑制miR-451的功能,发现miR-451能负调控肝脏糖异生和机体血糖水平。在整体和细胞水平的研究发现,甘油激酶(Glycerol kinase, Gyk)是miR-451的作用靶标,Gyk除了通过催化甘油生成3-磷酸甘油而调节以甘油为前体的糖异生,还通过Akt-FOXO1通路介导调控糖异生基因表达,从而实现对肝脏糖异生和机体血糖稳态的调控。进一步的研究发现,在高脂诱导的糖尿病小鼠和db/db小鼠肝脏中过表达miR-451或抑制Gyk的表达,都能抑制肝脏糖异生,显著改善小鼠的高血糖,提高小鼠的葡萄糖耐受能力。此外研究还发现,葡萄糖和胰岛素能上调肝细胞miR-451的表达;在高脂饮食诱导小鼠糖尿病的过程中,肝脏miR-451和Gyk mRNA持续升高,但Gyk蛋白在早期升高后不再继续升高,这些结果提示2型糖尿病时血糖和胰岛素升高可能通过上调肝脏miR-451而抑制Gyk表达,进而减少糖异生,从而有利于改善血糖。因此,miR-451和Gyk是治疗2型糖尿病的潜在靶标。

在本篇研究中,陈帅教授课题组首先通过蛋白质组学分析鉴定出SERCA2a是潜在的可以与SPEG发生相互作用的蛋白。研究人员利用免疫共沉降实验证明无论在体内还是体外,SPEG与SERCA2a都存在相互作用。随后通过在细胞系以及新生大鼠原代心室心肌细胞中进行一系列的实验,他们发现SPEG的第二个激酶结构域可以与SERCA2a相互作用、并直接磷酸化SERCA2a的Thr484位点,进而促进SERCA2a的寡聚化,最终增强SERCA2a转运钙离子的能力。

该研究不仅发现了miR-451和Gyk是维持血糖稳态的重要调控因子,而且揭示了miR-451和Gyk调控糖异生的新机制,为2型糖尿病治疗的研究提供了新的靶标和策略。

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该研究得到上海生科院营养所研究员李于的支持和帮助。该课题得到科技部、中科院和上海市科委的经费支持。

图一 SPEG-SERCA2a轴线调控心肌细胞钙离子稳态与心功能

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小干扰RNA是一种常见的基因沉默工具,进入细胞后可以引发相应基因的信使RNA快速降解。利用siRNA在NRVC敲降SPEG后,SERCA2a-Thr484的磷酸化水平及肌浆网的钙离子回流都受到了抑制,说明SPEG可以调控SERCA2a的功能。此外,将SERCA2a的Thr484位点突变成不能磷酸化的丙氨酸后,相较于野生型SERCA2a而言, 过表达SERCA2aThr484Ala突变蛋白的NRVC中肌浆网钙离子回流时间延长,进一步说明该磷酸化位点是SERCA2a的关键活性调控位点。

miR-451和Gyk调控肝脏糖异生和血糖稳态模式图

为进一步研究SPEG-SERCA2a这一轴线的在体功能,陈帅教授课题组利用Cre-loxp系统在成年小鼠心脏中特异性敲除Speg基因。与对照小鼠相比,SPEG心脏特异性敲除小鼠罹患严重的扩张型心肌炎,心功能显著降低、并随时间推移不断恶化,最终过早死亡。他们的机制研究显示,缺失SPEG的小鼠心脏中SERCA2a-Thr484的磷酸化水平以及寡聚化都显著降低;最为重要的是,在SPEG心脏特异性敲除小鼠的心功能发生异常之前,其心肌细胞中肌浆网的钙离子回流已经受到抑制。这些结果表明,SPEG-SERCA2a调控轴线具有重要的在体功能,SERCA2a功能受损是SPEG心脏特异性敲除小鼠发生心衰的重要原因。

综上,该项研究发现了心肌细胞中SERCA2a功能调控的全新机制,并且阐明了SPEG是恢复心肌细胞钙稳态以及心衰等心脏疾病治疗的新的分子靶标。

模式动物研究所博士生全超和李敏为本文共同第一作者,南京大学陈帅教授为本文通讯作者。

(模式动物研究所 科学技术处)

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